DNA在內源性或外源性因素的持續攻擊下形成的異常結構被稱爲DNA損傷。人體中的DNA損傷與衰老、神經退行性疾病、腫瘤等密切相關，繪制DNA損傷在基因組中的分布對于深入解讀其致病機制、研究DNA損傷修複耐受性、開發癌症診療策略、評估抗腫瘤藥物療效等方面均有著深遠意義。然而，目前測序DNA損傷的工具十分匮乏，由于DNA損傷的致突變以及複制阻滯特性，其信息難以通過二代測序技術讀取。面對類型多樣的DNA損傷，目前僅有極少數的DNA損傷借助二代測序與抗體富集/化學標記相結合的方法實現了測序，且難以避免抗體或化學標記策略特異性不足的問題，從原理上講，通過二代測序同時表征DNA中不同類型的DNA損傷也是極爲困難的。因此，引入新的DNA損傷測序方法對于推動DNA損傷相關的基礎研究以及相應疾病診療方案的開發而言十分重要。
納米孔測序作爲第三代單分子測序技術，具有直接測序核酸的技術優勢，在直接表征廣泛的核酸序列修飾或損傷方面極具潛力。然而，常規的納米孔測序分析（圖1A, Detection mode I）會産生測序錯誤，如對于目標修飾堿基的分辨率不足或檢測受序列環境幹擾而産生錯讀，以及目標堿基過孔速度太快而造成漏檢。
近日，我室黃碩教授課題組在Nano letters上報道了一種新型通過在納米孔測序中監測聚合酶阻滯動力學的DNA損傷測序方法（圖1 A, Detection mode II），利用單分子水平上DNA損傷與聚合酶活性位點間相互作用彙報出的酶阻滯動力學特征，成功實現了三種烷基化試劑誘導形成的致突變性與致癌性DNA堿基損傷O6-羧甲基鳥苷（O6-carboxymethylguanosine，O6-CMG）、O6-甲基鳥苷（O6-methylguanosine，O6-MeG）與無堿基位點（abasic site, AP site）的准確區分（圖1B）。並且，該方法也爲常規納米孔測序中出現的測序錯誤提供了解決方案。
圖1. 通過在納米孔測序中監測聚合酶阻滯動力學區分DNA損傷的概念演示。
DNA损伤在纳米孔测序中产生了具有高度一致性的聚合酶阻滞信号，表现为两个重复的电流平台之间的持续波动（圖2A）。從測序事件中繪制出酶沿DNA模板位置移動的軌迹，揭示了聚合酶在DNA损伤位点发生了阻滞（圖2B）。聚合酶阻滯顯著延長了DNA损伤通过孔道的总体时间，有助于规避在纳米孔测序中因目标堿基損傷太快通过孔道而产生漏检的测序错误。酶阻滞动力学特征分析结果显示，单分子聚合酶阻滞动力学能为DNA堿基損傷提供可靠的、不易受序列环境干扰的检测指标（圖2C-D），不同于受目標修飾堿基周圍序列影響而産生測序錯誤的常規納米孔測序讀�。竸恿W特征可能有助于檢測未知序列環境中的DNA損傷或修飾。O6-CMG、O6-MeG和AP site三種DNA损伤能够通过各自的单分子酶阻滞动力学特征实现准确区分（圖2E），而標准納米孔測序會造成O6-MeG的誤讀，且難以區分O6-CMG和AP site（圖3），充分驗證了酶阻滯動力學策略用于DNA損傷檢測的可行性及檢測能力。
圖2. 利用單分子聚合酶阻滯動力學鑒定DNA損傷。
圖3. 利用常規納米孔測序分析鑒定DNA損傷。
該工作以“Discrimination between Different DNA Lesions by Monitoring Single-Molecule Polymerase Stalling Kinetics during Nanopore Sequencing”爲題，于2022年6月17日發表于《Nano letters》（文章鏈接：https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acs.nanolett.2c01833，DOI: 10.1021/acs.nanolett. 2c01833）。我室博士生張金月與碩士生王宇爲論文的共同第一作者，黃碩教授爲論文的通訊作者，陳洪淵院士對該工作做出了重要指導。此項研究得到了尊龙凯时 - 人生就是搏!以及南京大學化學和生物醫藥創新研究院（ChemBIC）的重要支持，與國家自然科學基金（項目編號：31972917，91753108，21675083）、中央高校基本科研業務費資助（項目編號：020514380257，020514380261）、江蘇省高層次創業創新人才引進計劃（個人、團體計劃）、江蘇省自然科學基金（項目編號：BK20200009）、南京大學卓越計劃（項目編號：ZYJH004）、上海市市級科技重大專項、南京大學生命科學分析化學國家重點實驗室（項目編號：5431ZZXM1902）、南京大學科技創新基金資助項目、中國博士後科學基金（項目編號：2021M691508）等經費支持。
