單分子檢測技術具有超高靈敏度、良好選擇性、快速分析和低樣品消耗等顯著優點，是一種可快速且簡單地鑒定低濃度分子的理想方法。生物納米孔作爲一種易改造的單分子檢測工具，廣泛用于識別各類分子，包括DNA，RNA，蛋白質，碳水化合物和金屬離子等。目前已經報道了生物和化學的方法來拓展納米孔的應用，如利用定點突變、巯基化學等。如何更爲靈活的操縱納米孔的構建，從而拓展單分子檢測的應用範圍，已成爲該領域的研究熱點。
生物體可以通過20種天然氨基酸進行編碼和執行生理功能，但僅限于這些氨基酸對于改造蛋白質的結構和擴展蛋白質功能是遠遠不夠的。遺傳密碼擴展技術（GCE）是利用一對正交的氨酰tRNA合成酶/tRNACUA將非天然氨基酸（UAA）位點特異性的引入到蛋白質上，可用于原核、真核細胞、動物等體系中蛋白質生化功能的研究。此外，2022年的諾貝爾化學獎頒給了“點擊化學和生物正交”，生物正交化學代表了一類高産的化學反應，在生物環境中能夠快速且有選擇性地進行，成爲了生物分子可視化和分析強有力的工具。一些含有生物正交反應基團的非天然氨基酸的出現，極大地拓展了其應用場景。
那麽是否可以開發一種“可點擊”的生物納米孔，賦予納米孔新的功能呢？近日，黃碩教授課題組和謝然教授課題組合作在《德國應用化學》期刊首次報道了利用遺傳密碼擴展技術快速、有效地將生物正交反應基團引入到恥垢分枝杆菌膜蛋白A (MspA) 納米孔頂端。野生型MspA納米孔是天然的八聚体，作者利用正交性的氨酰tRNA合成酶/tRNACUA將含有疊氮基團的非天然氨基酸AzK引入到MspA的特定位點（D56），並通過凝膠電泳、質譜分析以及單通道電流表征，證實含有疊氮化物的八聚體M2 MspA-D56AzK已被成功制備（圖1）。爲了展現GCE技术在納米孔中的通用性以及納米孔与各种类型非天然氨基酸的兼容性，作者也成功将含有炔基的非天然氨基酸AlkK引入到MspA的特定位點中。
圖1. MspA中位點特異性引入非天然氨基酸
爲了驗證所引入非天然氨基酸的反應活性，作者通過點擊反應成功將DBCO（二苯並環辛炔）-官能化的單鏈DNA或溶菌酶偶联到納米孔道的顶端，并在单分子水平实时观测这些生物大分子的运动。特别地是，含有溶菌酶的嵌合袌D{米孔可以对溶菌酶的寡糖底物进行传感，实现了N-乙酰殼三糖（NAG3），N-乙酰殼六糖（NAG6）的同时检测和清晰区分（圖2）。這種酶-納米孔偶联策略允许实时监测酶促反应，提供更多的动态信息和测量连续性。
圖2. 溶菌酶嵌合納米孔与不同底物相互作用的单分子观测
工作以“Site-Specific Introduction of Bioorthogonal Handles to Nanopores by Genetic Code Expansion”爲題，于2023年3月16日在《Angewandte Chemie International Edition》發表相關論文（文章鏈接：https://doi.org/10.1002/anie.202216115，DOI: 10.1002/anie.202216115）。黃碩教授和謝然教授爲該論文的共同通訊作者，謝然課題組博士生楊晶和黃碩課題組博士生王可凡爲該論文的共同第一作者。此項研究得到了尊龙凯时 - 人生就是搏!以及南京大學化學和生物醫藥創新研究院（ChemBIC）的重要支持，以及科技部國家重點研發計劃（項目編號：2022YFA1304602）、國家自然科學基金（項目編號：2207070006,22225405和31972917）、中央高校基本科研業務費資助項目（項目編號：020514380257）、江蘇省高層次創業創新人才引進計劃（個人、團體計劃）、江蘇省自然科學基金（項目編號：BK20200009和BK20202299）、南京大學優秀科研項目（項目編號：ZYJH004）、上海市市級科技重大專項、南京大學生命科學分析化學國家重點實驗室（項目編號：5431ZZXM2204）、中國博士後科學基金資助項目（項目編號：2021M691508, 2022T150308）等經費支持。
